急性 GVHD 诊疗的「导向路标」：免疫状态监测

急性移植物抗宿主病 (aGVHD) 是由于移植后异体供者移植物中的 T 淋巴细胞，经受者发动的一系列「细胞因子风暴」刺激，大大增强了其对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标。

急性移植物抗宿主病的发生率为 30%～45%，慢性者发生率低于急性。

近日，河北燕达陆道培医院收治了一位成年 GVHD 患者，想与各位同仁分享其诊疗过程。需要注意的是，该患者在移植前，行化疗治疗后提示粒缺期合并感染性皮疹，抗感染治疗后好转。

而在移植后，患者再次发生皮疹，需要与皮肤 GVHD 相鉴别。期间我们对该患者进行的免疫状态监测便成为诊疗过程中的「导向路标」。

外院诊断为「骨髓增生异常综合征-RAEB2」, 移植后出现急性 GVHD

患者男，29 岁，外院经骨髓 MICM 检查后诊断为「骨髓增生异常综合征-RAEB2」，伴 ASXL1、IDH2、U2AF1 突变，染色体+8 核型。2021 年 11 月 26 日行造血干细胞移植，+28 天结果显示未移植成活。

+29 天出现腹痛腹泻，诊断为「急性肠道移植物抗宿主病（GVHD）」，予以激素、巴利息单抗抗 GVHD 治疗。

1 个月后免疫监测提示患者好转，CD38+活化 T 细胞减低，总 T 细胞减低，但是 CD8+T 细胞比例及效应记忆 T 细胞比例持续升高，CD8+T 细胞呈现显著的免疫活化状态，Treg 细胞持续为 0。此时鉴于肠道 GVHD 病情好转，激素逐渐减量。

几天之后，患者皮肤出现鲜红色皮疹，为求进一步诊治，患者收入我院移植科。

入院时全身皮肤散在红色皮疹，进行免疫监测

患者入院时，生命体征平稳，全身皮肤散在红色皮疹。四肢、腹股沟可触及数个包块，最大处鹌鹑蛋大小，按压无明显疼痛。心肺腹查体阴性。

01 全血细胞分析

白细胞计数：2.80*109/L

红细胞计数：1.89*1012/L

血红蛋白：63 g/L

血小板计数：88*109/L

中性粒细胞计数：2.00*109/L

02 凝血七项

血浆凝血酶原（PT）时间：12.9 s (参考范围：9.4-12.5 s)

PT%：74% (80-150%)

国际标准化比值（INR）：1.21(0.8-1.2)

纤维蛋白原：4.79 g/L(2.0-4.0 g/L)

D-二聚体：0.26 μg/mL(0-0.23 μg/mL)

03 免疫监测

值得注意的是，我们对该患者进行了免疫监测，具体的方案为：6c TBNK+绝对计数，Treg 及活化 T 细胞。

监控项目

CD3+T、B 淋巴细胞、CD4+T、CD8+T、NK 细胞、NKT 细胞、Treg 细胞、CD38+CD8+T、CD38+CD4+T、CD4+/CD8+等。

监控时间

移植前患者及供者淋巴细胞亚群、移植后，当 WBC 植活后，四个月内应每周监测淋巴细胞亚群，如发生增殖性疾病、感染或 GVHD 应增加监测频率，另外在患者减免抑制剂时应密切监控免疫亚群变化。

四个月后如患者状态一般应持续监测免疫功能，如免疫功能状态良好则可每月监测一次观察免疫重建及状态。

监控方法

采集血样后送检，采用流式细胞术检测。

诊断结果：皮肤 GVHD 可能性大

诊疗经过

患者在 2021 年 11 月 26 日行造血干细胞移植，移植后 54～76 天之间发生肠道 GVHD，经抗 GVHD 治疗后缓解，鉴于肠道 GVHD 病情好转，过程中激素逐渐减量。几天之后出现鲜红色皮疹。

但是通过流式免疫亚群结果，患者多次监测提示 Treg 细胞数极低，移植后 NK 细胞数明显低于供者，B 细胞，CD4+/CD8+的比值严重倒置，已经持续提示 GVHD 的倾向，此时调整治疗方案，在增免疫抑制剂同时应增加免疫亚群监测频率，结合细胞因子检测观察患者病情，去判断 GVHD 诊治情况。

自 2022 年 1 月 18 日到 2022 年 2 月 9 日显示免疫细胞各比例增高，CD8+T 及 CD38+CD8+T 显著升高，Treg 细胞持续为 0，B 细胞数目极低，提示前期 GVHD 反复，停用环孢素，换用更强效的免疫抑制剂他克莫司并使用 ATG，加强抗 GVHD 治疗。

在 2 月 21 日监测 GVHD，距离移植 88 天后，距离上次检测 13 天后，GVHD 病情改善，监测免疫细胞亚群较上次有所恢复，治疗方向合理。（患者监测时间及结果见表 1）

病例讨论：在本例病例中，监测免疫细胞亚群的结果为我们早期诊断 GVHD 和治疗起到了很大的帮助。

Allo-HSCT 是临床应用最有效的血液肿瘤治疗方法之一。患者移植后造血功能重建一般在 15 天左右，而免疫功能重建恢复较慢。研究表明 [1-2] 移植后一个月内 CD3+T 细胞数量明显减少，一般于 3 个月后逐渐恢复正常。

CD8+T 细胞恢复较快，CD4+T 细胞恢复较慢，12 个月时逐渐恢复至正常水平，一年内 CD4+/CD8+比值持续倒置。

相关研究显示，淋巴细胞各亚群尤其是 T 淋巴 细胞亚群的动态平衡与机体免疫功能状态密切。

而有研究显示 Treg 细胞可以移植免疫细胞的功能和活化，其在移植后有诱导淋巴细胞免疫重建的作用，在急性 GVHD 患者 Treg 细胞有显著减低。NK 细胞是机体重要的免疫细胞 [3-4]，来源于 CD34+造血干细胞，在骨髓内发育成熟。

大多数文献表明 NK 细胞在全相合造血干细胞移植后 1 个月即可达到供者水平，与非急性移植物抗宿主病 (GVHD) 患者相比，急性 GVHD (aGVHD) 患者在移植后 NK 亚群。

我们做了一项在对移植后患者的免疫检测过程中的实验，以预后结局死亡/存活为终点进行差异性分析，使用非参数检验 Mann-Whitney U test，死亡组和存活组存在各亚群绝对计数存在显著差异，如图 1，表 2。在百分比除 NK 细胞外均无统计学意义。故移植后淋巴细胞亚群的免疫功能监测使用绝对计数比使用百分比更有意义。

移植后一年内，存活组患者和 GVHD 死亡组患者之间淋巴细胞亚群绝对计数和淋巴细胞亚群百分比均值变化曲线

我们发现免疫重建状态较好、GVHD 级别较低并不发生慢性 GVHD 的患者，在移植后一年，最迟两年能达到正常水平，CD4+/CD8+比值恢复，如下表格患者。而移植后三个月内免疫功能不能恢复，尤其 T 细胞数持续 100 以下，尝试减免疫抑制剂，则会加重 GVHD 程度，类似患者几乎均为重症感染办伴重症 GVHD 死亡，如表 3 所示的患者监测情况：

Allo-HSCT 后，患者的免疫重建与临床预后密切相关，尽管移植后免疫重建及免疫耐受的机制，机体 GVL 及 GVHD 机制等 [5]，目前并不完全清楚，但移植后免疫细胞的恢复情况与临床预后之间的相关性却能给移植患者的术后管理方面给出一些提示，指导制定合理的免疫重建监测方法，以及早期采取药物或供体淋巴细胞输注等方式干预免疫重建，我们也会进一步进行监测与临床统计，以期能让患者获得更好的临床预后。

总结

1、移植后 WBC 植活后的首次淋巴细胞监测结果，当患者 Treg 细胞数极低时，应结合细胞因子水平，提示患者有发生急性 GVHD 的风险。

2、当患者在 GVHD 期出现 CD8+T 的显著增殖，CD4+/CD8+的比值严重倒置，说明前期 GVHD 未处理妥当，应结合细胞因子水平，提示持续 GVHD 的风险，在 1 月 18 日距 2 月 9 日期间，应增加免疫细胞亚群监测的频率。

3、当患者移植后 NK 细胞数明显低于供者，B 细胞、Treg 细胞极低，CD4+/CD8+的比值严重倒置，此时应结合细胞因子检测观察患者病情，提示 GVHD 倾向。

参考文献：

[1] Ying-Jun Chang, Xiang-Yu Zhao, Xiao-Jun Huang. Effects of the NK cell recovery on outcomes of unmanipulated haploidentical blood and marrow transplantation for patients with hematologic malignancies. [J]. Biol Blood Marrow Transplant. 2008 Mar;14(3):323-34.

[2] Ando T．Impact of graft sources on immune reconstitution and survival outcomes following allogeneic stem cell transplantation［J］．Blood Adv，2020，4( 2) : 408-419．

[3] Julia Drylewicz, Ingrid M M Schellens, Rogier Gaiser,et. Rapid reconstitution of CD4 T cells and NK cells protects against CMV-reactivation after allogeneic stem cell transplantation. J Transl Med. 2016 Aug 2;14(1):230.

[4] 曹勋红, 余星星, 胡利娟, 等. 异基因造血干细胞移植后 NK 细胞免疫重建的研究进展 [J]. 现代免疫学, 2019, 39(01):64-67.

[5] Zhang J．The mechanistic study behind suppression of GVHD while retaining GVL activities by myeloid-derived suppressor cells［J］．Leukemia，2019，33( 8) : 2078-2089．