MICM 整合诊断技术解析（五）：基因分析

MICM 整合诊断技术解析连载内容的最后一期迎来基因分析专题，仍然由大家所熟悉的高博医学（血液病）北京研究中心北京高博博仁医院童春容主任为我们深入解读。

血液肿瘤是一类由于造血干/祖或前体细胞染色体异常或基因变异，导致细胞增殖、分化或凋亡异常，恶性血液细胞大量增加的疾病。

基因异常主要类型

1、染色体异常导致的基因异常

如染色体丢失或断裂导致该染色体上全部基因功能丢失；染色体断裂后与另一基因拼接形成一新的融合基因，产生基因功能异常等等。染色体异常可采用染色体核型分析及荧光标记探针的原位杂交技术（FISH）来检测。

2、大片段基因丢失或重复等

如急性 B 淋巴细胞白血病有 IKZF 基因大片段的缺失预后不好。可结合多重连接探针扩增技术（MLPA）和基因测序仪来检测分析。

3、融合基因

融合基因指原来的两个基因断裂，重新拼接形成融合基因。

目前，很多以融合基因命名的独立急性白血病类型，如急性淋巴细胞白血病伴 ETV6-RUNX1 融合基因，它的预后好，化疗治愈率高达 90% 以上。

过去，想要一次检测多种融合基因，临床上多采用多重巢氏 PCR 方法，这种方法只能检测已知的融合基因，而且如果设计的试剂与患者融合基因断裂点不相符就检测不出来，所以漏检率很高。目前已经采用二代测序方法（NGS）检测融合基因，几乎可以检测出检测范围内的融合基因。

融合基因几乎只存在于肿瘤细胞上，初诊或复发时筛查出的融合基因可以作为肿瘤标志物，以后用实时定量 PCR 监测残留白血病，或者深度测序定量；敏感度可以达到 10 万分之一甚至百万分之一，也就是说，10 万或百万个细胞中有一个白血病细胞都能检查出来。临床医生可以通过监测白血病融合基因来了解治疗效果、调整治疗方案。

4、基因变异

基因变异既往称基因突变。近年来，学术界统一将「基因突变」改为「基因变异」，因此，以下统一称为「基因变异」。

基因变异是指一个人的基因上单个或者多个核苷酸序列改变，和正常人不一样，包括核苷酸缺失或插入、扩增、复制等。检测基因变异的方法主要有一代测序及 NGS 方法。

一代测序法（Sanger 法）的测序长度可达 600-1000bp, 是目前测序方法中读长最长的，但 Sanger 测序法的检测灵敏度有限，对于单个核苷酸点变异的检测灵敏度为 10%～15%，也就是说，白血病细胞比例需要在 10% 以上才能用该方法测出。此外，一代测序法慢，很难一次检测大量的基因。

NGS 又称为高通量测序，具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势，可以较快检测出几百种甚至全基因测序，对 DNA 和 RNA 序列进行分析。

NGS 一次筛查很多白血病基因可以发现一个患者携带的多种基因变异。同样是急性白血病类型，不同患者携带的基因变异种类及组合、频率可能很不一样，它们可以预测白血病的预后、指导靶向用药。治疗后可用 10 万层以上的深度测序定量这些变异基因，可以判断疗效，帮助指导调整治疗方案甚至治疗路线。

由于 NGS 大量用于临床指导治疗，后面会较详细地分析。

5、基因表达异常分析

多种恶性肿瘤是由于原癌基因或转录基因激活所致，表现为原癌基因或转录基因定量明显升高，如 WT1 等。所以一些医院会通过这些原癌基因的定量来监测白血病治疗的疗效。

6、基因调控分子异常

基因表达（从基因到形成蛋白质的过程）会受很多调控分子的影响，如 microRNA、表观基因的调控、组蛋白的修饰等；如果这些调控分子异常，也会导致最后基因编码的蛋白质及其功能的异常。

7、基因拷贝数的变化

一些患者的基因拷贝数明显异常或基因表达谱异常，与恶性肿瘤的发生发展也有关系。临床上可以采用基因芯片技术与检测来分析基因拷贝数的变化。

血液肿瘤诊治临床应用的基因检测技术

1、融合基因检测

染色体断裂，不同部位的两段基因融合在一起就形成了融合基因。一些重现性融合基因的检测具有决定性诊断及预后作用（见染色体节）; 而治疗后定期监测融合基因，是最敏感的监测微小残留肿瘤（MRD）的方法; 一些融合基因还有指导靶向药的作用。

检测融合基因的方法主要包括：染色体、FISH、多重聚酶链反应（PCR）、基因测序方法；一次性筛查多种融合基因的方法主要有多重巢氏 PCR 及 NGS。

1）初治时的融合基因检查

目前对于初治白血病，很多医院常常用染色体、FISH、PCR 检查融合基因；但近年来，NGS 逐渐广泛用于融合基因的筛查。

当染色体发现有融合基因，可以再用 FISH 或 PCR 的方法验证。有时染色体断裂易位的片段很小，用普通染色体核型分析方法检测不出来，但是可以用 FISH 或 PCR 检测出相应的融合基因，称为隐匿性染色体易位，这些融合基因具有与该染色体易位相同的价值。

因此初治时，很多医院用 FISH 检测世界卫生组织（WHO）分类中出现的融合基因；或者用多重巢氏 PCR 筛查常见的融合基因。

但 FISH、多重巢氏 PCR 只能检测已知的融合基因，FISH 检测需要购买已知的荧光标记探针、多重巢氏 PCR 需要提前设计检测引物及探针。一旦患者的融合基因是未知的，就不能用以上方法检测到；或者断裂点不在检测的引物或者探针可检测范围，多重巢氏 PCR 就不能检测到。

根据既往的统计，多重巢氏 PCR 检测急性白血病，只有 40%-50% 的患者检测到融合基因，而且绝大多数患者只能检测到一种融合基因。

而 NGS 方法不需要检测试剂，可以检测目标基因上任何断裂点的融合基因，绝大多数患者可以检测到一个甚至多个融合基因，为疾病的诊断、预后判断、靶向药的准确、MRD 的监测提供了很好的指标。

2）治疗后融合基因的监测

融合基因是血液肿瘤，尤其是白血病非常特有的标记，治疗后定量监测可以反应白血病的疗效，提前预测可能的复发。目前最敏感的融合基因定量方法为荧光标记实时定量 PCR（Q-PCR）。

2、基因变异的检测

每位血液肿瘤患者都存在基因变异。基因变异包括基因大片段丢失或扩增，碱基或片断的丢失、插入、重复或增加。基因大片段丢失或扩增（数百万碱基以上的片段变化）可用染色体核型分析或 FISH 检测；检测数百万碱基以下的片段变化可用基因芯片技术进行基因片段拷贝数变异（CNV）分析，又称为 CNV 芯片技术；但是对数百个碱基长度以下的片段变化，尤其是基因碱基点变异需要用基因测序技术。

随着基因检测技术迅速用于临床及研究，我们发现血液肿瘤的基因变异具有重要的临床意义，从而更促进了基因检测技术的发展。2008 WHO 造血与淋巴组织肿瘤分类开始将基因变异作为血液肿瘤的诊断及分类标准。

基因测序是检测基因变异最常用方法，可以检测目的基因的全部变异类型，与既往的方法比较可以提高基因变异的检出率。

如核仁磷酸蛋白基因 1（NPM1）有 40 多种变异位点，既往的方法只能检测其中最常见的 10 种变异位点，而目前的二代测序方法可检测几乎 NPM1 的全部变异位点。

有一些血液肿瘤，由于组织标本少，其它方法难以有足够标本诊断；或治疗获得完全缓解后来到我院，怀疑既往的诊断，这时基因测序就可以用骨髓/血涂片、组织切片、组织印片等少量标本来做几十种甚至全基因变异筛查。

基因变异检测的意义

1、帮助诊断血液肿瘤

一些血液肿瘤，比如骨髓增殖性肿瘤（MPN）、骨髓增生异常综合征（MDS）、MDS/MPN 综合征等，因为没有特异性的免疫学、染色体或融合基因异常，在早期时主要表现为血液细胞轻度升高或降低，因此难以与再生障碍性贫血、类白血病反应等良性疾病鉴别，既往诊断主要靠排除多种疾病，并需要较长时间的观察才能诊断。

而几乎所有恶性血液肿瘤都能检查到某种或多种基因变异，因此当具有一些患者有以上血液肿瘤的临床表现及一些实验室特征时，相关基因变异阳性对这些疾病的诊断有重要意义。基因变异检测可明显提高恶性血液肿瘤的准确率及速度。比如：

JAK2（包括 V617F 和 Exon12）基因变异在髓系恶性肿瘤诊断中的价值：JAK2 基因变异可见于多种 MPN 及其它血液肿瘤。JAK2 V617F 变异见于约 95% 的真性红细胞增多症（PV）, JAK2 Exon12 变异见于 2-5% 的 PV，实际上全部的 PV 患者都有 JAK2 的激活性变异。JAK2 V617F 变异见于 50-60% 的原发性血小板增多症（ET）或原发性骨髓纤维化（PMF），50-80% 的伴铁粒幼红细胞及血小板增多的难治性贫血（RARS-T）有 JAK2 V617F 变异。

但是其它一些血液肿瘤也可伴 JAK2、V617F 基因变异，如见于 8% 的慢性粒单核细胞白血病，还可偶见于少数急性髓系白血病（AML）、MDS、慢性髓性白血病（CML）。

研究显示，70% 的幼年型粒单核细胞白血病（JMML）有累及粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）信号传导途径的变异，如 NRAS、KRAS、PTPN11、CBL 等。Meggendorfer M 等（2012）对 275 例慢性粒单核细胞白血病（CMML）分析了 SRSF2、ASXL1、CBL、EZH2、JAK2 V617F、KRAS、NRAS、RUNX1、TET2 基因变异。发现 93% 的 CMML 至少有一种基因变异，47%（129/275）的患者有 SRSF2 基因变异，其中 120 例为 SRSF2 Pro95 变异。

近年的研究发现以下基因变异常见于 MDS：TET2、ASXL1、DNMT3A、EZH2、SRSF2、SF3B1、IDH1、IDH2、U2AF1、ZRSR2。在 MDS 患者中，以下基因变异发生率分别为：TET2 20.5%-25%，DNMT3A 3%-13%，ASXL1 14.4%-20.7%，EZH2 6.4%-12%，IDH1/2 4%-12%，SF3B1 见于 6%-18% 非环形铁幼细胞性难治性贫血-MDS（RS-MDS）、57%-75.3% 的 RS-MDS，SRSF2 1.5%-11.6%，U2AF1 8%-12%，ZRSR2 1.4%-8.0%。U2AF1 基因变异多见于 ASXL1 变异或 20q-染色体异常的 MDS 患者。

ASXL1 基因变异见于 MDS、CMML、AML 等髓系肿瘤患者，更多见于 CMML；见于 38%-43% 的 MDS/MPN 综合征，2%-10% 的前列腺癌。

一些基因变异已经进入 WHO、或者国际协作组的诊断分型标准中，如 CEBPA、NPM1、RUNX1 等。

2、预后价值

临床指标、染色体、融合基因、基因变异、免疫标志都具有良好的预后价值。但临床医生要注意恶性肿瘤是多个基因变异引起的，每个患者可有多个基因变异，不同变异之间可以相互作用，因此分析基因变异时要综合判断。

基因变异的预后意义还与变异的位点、变异频率有关，所以还要了解不同变异位点及其频率的意义。

Elli Papaemanuil 等（2016）在新英格兰杂志报道了对 AML 病例进行基因变异研究的结果，他们研究了 1540 例 AML 患者的 111 种癌症基因变异、染色体及临床资料，以确定 AML 的基因变异价值：患者来自三个采用强化疗的多中心临床试验，一组为 18-65 岁，一组为 18-61 岁，一组为 18-84 岁；中位观察 5.9 年，发现了 5234 个驱动基因，累及 76 个基因或者区域；发现 96% 的患者至少有一个驱动基因，86% 患者有 ≥ 2 个驱动基因。

研究结合染色体、融合基因（FG）及基因变异将 AML 分为 10 多类，最终发现更多影响预后的基因变异，基因之间相互作用会对结果产生影响；而患者白血病的驱动基因变异数量越多，总生存率（OS）越低，与初治时的年龄和白细胞计数无关；AML 随着时间的发展，常伴随多个克隆同时存在，这说明 AML 是复杂的。

染色体、融合基因、不同基因变异的组合影响预后。如 AML 同时有 TP53 变异及亚二倍体染色体或者复杂染色体异常，几乎无长期生存，比仅有单独一种异常的患者预后更差；同时携带 ASXL1 及 SRSF2 基因变异的预后也比仅有一种的差很多，几乎无长期生存；同时携带 MLL-PTD 及 FLT3-TKD 变异预后很差；同时携带 DNMT3A+IDH2 或 DNMT3A+NPM1+FLT3-ITD 或 DNMT3A+NPM1+NRAS 预后很差等。

因此，2017 年欧洲白血病网络（ELN）将基因变异纳入预后 AML 的预后分层指标。随后美国国家癌症网络（NCCN）也采纳了 ELN 的预后分层标准。

3、帮助选择靶向药物

基因变异检测指导靶向药使用越来越成为血液肿瘤的重要治疗方法：

FLT3-ITD 变异 AML 患者可用索拉非尼（主要对 FLT3-ITD 变异有效）、舒尼替尼、吉瑞替尼、米哚妥林等靶向治疗药物暂时获得完全缓解或部分缓解。目前，米哚妥林联合化疗已经是 FLT3 变异 AML 的一线治疗方案。

有 KIT 基因变异者用甲磺酸伊马替尼等酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗有效。

伴 IDH 基因变异的患者可从 IDH 抑制剂获益。美国食品和药品管理局（FDA）已经批准艾伏尼布（ivosidenib）单药治疗老年性 IDH1 变异的 AML；恩西地平（enasidenib）用于治疗难治复发的 IDH2 变异的 AML。

DNA 的甲基化异常者通过分离染色质与 CpG 岛甲基化的异常以灭活肿瘤抑制基因、激活原癌基因；表观基因异常通过基因的去甲基化或影响小 RNA 的机制导致恶性疾病的发生。

表观遗传学基因变异还可能是基因不稳定的原因，治疗后易诱发 FLT3-ITD 变异，导致白血病耐药复发（Wakita S 等，2012）。表观调节基因 TET2、IDH1、IDH2、DNMT3A、ASXL1 等变异，MLL 基因变异可采用甲基化抑制剂（5 氮杂胞苷、地西他滨）及组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂治疗有效，尤其是 TET2 基因变异者用 5 氮杂胞苷疗效好。

目前维奈托克联合 5 氮杂胞苷已经是老年性 AML 的一线治疗方案。而维奈托克联合去甲基化药及其它靶向药，可能广泛用于多种血液肿瘤的治疗，使一些既往需要异基因造血干细胞移植的高危险性患者达到治愈。

伴 NRAS 或 KRAS 基因变异的 AML 患者可以用曲美替尼或考比替尼等治疗，可从大剂量 AraC 化疗获益。

以下基因变异可能用全反式维甲酸（ATRA）治疗获益：FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、MLL 基因易位。

伴 JAK 基因变异的血液肿瘤可从 JAK 基因拮抗剂治疗获益。

4、增加追踪 MRD 的指标

绝大多数血液肿瘤都有基因变异，治疗后可用 10 万层以上深度测序或者数字定量 PCR 定量这些变异基因，可大大提高基因监测 MRD 的覆盖率，以帮助判断疗效，帮助治疗决策。

5、复发机制的探讨

根据目前深度基因测序结果，每个血液肿瘤患者都可检测出多种基因变异，中位变异数达 10 多个，甚至可有 50 多个基因变异。

一些基因变异存在于几乎全部血液肿瘤细胞中，是基础变异基因；一些为驱动基因变异，一些是伴随基因变异；同一患者的血液肿瘤细胞可有不同基因变异的克隆，一些是主要克隆，一些是小克隆，还有一些为肿瘤前期克隆；治疗缓解后主要的克隆消失，肿瘤前期克隆持续存在，如果各种因素导致肿瘤前期克隆获得新的基因变异，细胞获得生长优势、失去分化成熟或凋亡的能力，血液肿瘤复发；或治疗前耐药的小克隆增长成为主要克隆，血液肿瘤复发。

这些提示血液肿瘤的复杂性及攻克的难度。我们可能需要多种方法、多种途径攻克它。由于化疗、放疗是基因变异诱变剂，如何减少诱变剂，防止细胞发生新的基因变异，从而减少耐药或复发也是我们需要努力的。

美国 MD Anderson 癌症中心计划对惰性 B 细胞淋巴瘤不用化疗，而主要用靶向药物、免疫治疗、微移植等方法，在 5～10 年内使其治愈率提高 1 倍；对侵袭性 B 细胞淋巴瘤计划采用化疗联合靶向药物、免疫治疗、移植等方法，在 5～10 年内使其治愈率提高 1 倍。

此外，2016 年 WHO 首先将遗传易感性髓系肿瘤（髓系肿瘤携带天生或遗传容易患髓系肿瘤的基因变异）单独归类，因为这类患者多数需要移植，对不同遗传易感基因患者的移植方案也应该有所调整；而且对亲缘家属供者应该对这些遗传易感基因进行筛查，以选择更好的供者。

近年来还发现越来越多的血液肿瘤遗传易感基因及天生易感基因（患者在胚胎期就携带了容易患血液肿瘤的遗传易感基因），因此遗传易感基因也成为热点研究方向。

6、提供新的免疫治疗方案

如果检测很多基因，发现很多基因变异，有些基因变异产生的蛋白具有免疫原性，这是肿瘤细胞上独有的。因此可以通过这些具有免疫原性的基因变异，开发新抗原疫苗或抗原特异性 T 淋巴细胞治疗，来清除 MRD，提高治愈率。但是基因变异的检测尚有其局限性，解读时应注意。

目前全基因组测序、全外显子测序、目标基因的测序等多种技术如火如荼开展，基因信息呈爆炸式的增长，如何判读这些信息，哪些是不同人的多态性，哪些是致病的基因变异还是需要深入研究的问题。

血液肿瘤是多个基因变异引起的疾病，每个患者可有多个基因变异，每个基因变异的类型也可以是多种，相同的基因在不同患者变异类型也不同，其临床意义也不同，不同变异之间可以相互作用，每个患者的基因变异类型组合等共同组成了患者疾病的独特性；这导致解读血液肿瘤基因变异临床意义的复杂性。我们在阅读文献、研究时要注意这些细节。

我们团队曾遇到几例家族性噬血细胞综合征（FHLH）基因缺陷及 EBV 相关的霍奇金淋巴瘤（HL），放化疗后患者获得完全缓解（CR），也曾预测肿瘤会复发，但 3 年多过去了，患者未复发；而另一例患者在 13 年后复发。这些现象提示我们，那些易感基因会影响临床治疗路线的选择尚有待长期临床和实验室的观察。

7、药物代谢基因的检测

药物代谢受遗传基因类型或肿瘤基因变异的影响，检测这些基因可提前预测药物疗效及副作用，帮助药物组合及剂量的选择。6-巯基嘌呤或 6-硫鸟嘌呤是 ALL 治疗的主要药物之一，其疗效及副作用受硫代嘌呤甲基转移酶（TPMT）活性的影响。

最新的 NCCN 指南提出，根据患者 TPMT 基因型来调整药物剂量。如肿瘤细胞有 CREBBP 基因变异对激素容易耐药，所以对有该基因变异者应加大激素剂量或者适当调整化疗方案等。

基因拷贝数检测

2015 年欧洲血液学会年会报告了基因片段拷贝数变异（CNV）分析在血液肿瘤预后分层中的价值。

和传统的比较基因组杂交技术（CGH）相比，CNV 对血液肿瘤预后分层更有优势，有其它技术难以替代的特点。因为肿瘤和遗传病经常会有某个基因所在的染色体片段丢失或拷贝数的增加，有时可能是某个基因的一部分发生了缺失，即基因的拷贝数变化。

当缺失的片段长度在数千至数百万碱基之间时，染色体核型分析（适用于检测数百万碱基以上的片段变化）并不能发现，而基因测序（适用于检测数百个碱基长度以下的片段变化）难以检出时，CNV 芯片可以通过使用几十万至数百万个遍布于基因组上探针信号的检测，分析全基因组范围的所有连续超过数千个碱基以上的片段缺失或扩增，弥补了上述两种检测技术之间的不足。

免疫球蛋白及 T 细胞抗原受体 基因克隆性重排分析及高变异率分析

干细胞向淋巴细胞分化过程中，T 细胞抗原受体（TCR）和免疫球蛋白（IG）基因的可变区（V）和结合区（J）基因会发生重排，即两个距离很远的片段重新排列在一起，形成新片段，每个淋巴细胞都有各自序列不同的 TCR 或/和 IgH 片段。

淋巴细胞肿瘤增殖呈单克隆性，如果检测出一种基因重排片段明显升高可考虑有单克隆淋巴细胞增生。因此 IgH 及 TCR 基因重排分析技术可帮助鉴别淋巴细胞是否为单克隆性增生。

IG/TCR 重排的克隆性是伴随出现的现象。因此 IG/TCR 重排分析天然不是具有很强特异性的分子指标，相对于其它基因检查项目，具有较高的假阳性率。

临床医生往往把免疫球蛋白重链（IGH）重排当作恶性 B 细胞肿瘤的标志，而把 TCR 重排当作恶性 T 细胞肿瘤的标志，但 IGH、IGλ轻链（IGL）、IGκ轻链（IGK）、TCRγ链（TCRG）、TCRβ链（TCRB）、TCRδ链（TCRD）重排并无系列特异性特征。

偶尔在急性髓系白血病（AML）患者中亦可检测到 IGH 和 TCR 基因的克隆性重排，即序列失真现象。有时一些非恶性疾病也可能检测到 IGH 和 TCR 基因的克隆性重排，尤其是 TCR 基因重排，如 EB 病毒感染、移植后使用免疫抑制剂及一些皮肤 T 细胞良性增殖。检测使用的标本太少也可能导致克隆性重排的假象。

因此 IG/TCR 重排克隆性分析人员应有较深的免疫学、病理学和血液学临床知识背景，分析结果时应密切结合病理学检查，临床情况、标本采集时有无感染、自身免疫病等情况综合分析，尤其应注意肿瘤性的单克隆和免疫反应导致的寡克隆现象的区分。

IGH 体细胞超变异（IGH-SHM）分析是建立在存在 IGH 重排克隆性的基础之上的。因此只有 IGH 重排克隆性阳性的标本才可以用来进行 IGH-SHM 分析。目前一般将 IGH-SHM 分析作为 CLL 预后分析的指标，认为 IG 可变区全长的变异率<2% 时提示克隆性细胞未经过体细胞高变异过程，较为幼稚，预后差。

病原学分析

越来越多的研究发现，病原感染与某些类型的血液肿瘤有关，如成人 T 淋巴细胞白血病病毒（HTLV）与成人 T 细胞血液肿瘤/淋巴瘤（ATLL）有关，EB 病毒（EBV）、人类疱疹病毒 8 型（HHV8）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、胃幽门螺杆菌（HP）、一些肠道杆菌等与淋巴系统肿瘤有关，一些病原感染还可能与某些遗传免疫缺陷有关。

与 FHLH 相关的淋巴瘤常有 EBV 等病毒感染，而这些病原相关的血液肿瘤与临床预后及治疗选择都相关。病原检测已经作为血液肿瘤的分型指标之一，对治疗选择有帮助，如 HP 阳性的淋巴瘤可能用抗 HP 治疗获益等。

目前很多医院检测这些病原主要通过检查病原抗体来间接反应。但是当患者免疫力下降，抗体不升高时会漏诊。笔者曾比较过白血病患者血丙肝病毒基因（HCV-RNA）及相应抗体（抗-HCV）的检测结果，发现仅 50% 血 HCV-RNA 阳性的白血病患者抗-HCV 阳性，因此检测血液肿瘤患者的病原时，建议直接检查肿瘤部位、血液及其它部位的病原，而不仅仅查病原抗体。

一些病原主要存在于血液肿瘤部位，当病原进入血液等部位，是预后不好的指标，因此可检测血液的病原含量了解病情。由于累及血液肿瘤的抗原较多，我们可先用多重巢氏 PCR 检查多种病毒基因，对阳性标本再用实时荧光定量 PCR 检测病毒载量，高于正常者才有病理意义。