两种 CD19/CD22 双靶点 CAR-T 细胞治疗策略在儿童 PAX5 基因变异复发/难治性 B 细胞急性淋巴细胞白血病中的疗效对比研究

来源：《临床儿科杂志》

作者：李 月1,2 谢志伟1 汤燕静2 李本尚1,2

作者单位：1. 安徽医科大学第二附属医院儿科；2. 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心血液肿瘤科

基金项目：国家自然科学基金项目；安徽省健康研究计划；安徽医科大学科研基金；安徽省科技厅临床医学研究转化专项

推荐引用格式：

李月, 谢志伟, 汤燕静, 等. 两种 CD19/CD22 双靶点 CAR-T 细胞治疗策略在儿童 PAX5 基因变异复发/难治性 B 细胞急性淋巴细胞白血病中的疗效对比研究 [J]. 临床儿科杂志, 2026, 44(6): 508-517 DOI:10.12372/jcp.2026.26e0038

LI Yue, XIE Zhiwei, TANG Yanjing, et al.A comparative study on the efficacy of two CD19/CD22 dual-targeting CAR-T strategies in children with relapsed/refractory B-cell acute lymphoblastic leukemia with PAX5 gene variations[J].Journal of Clinical Pediatrics, 2026, 44(6): 508-517 DOI:10.12372/jcp.2026.26e0038

摘要

目的 抗原逃逸（尤其 CD19 缺失）限制 CD19 靶向嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）治疗儿童复发/难治性 B 细胞急性淋巴细胞白血病（R/R B-ALL）的疗效，PAX5 基因变异可破坏 CD19 表达稳定性、增加复发风险。本研究旨在比较联合输注与双顺反子两种 CD19/CD22 双靶点 CAR-T 细胞治疗策略在 PAX5 基因变异 R/R B-ALL 患儿中的疗效。方法 回顾性分析 2019 年 11 月 5 日至 2023 年 5 月 31 日医院收治的 PAX5 基因变异 R/R B-ALL 患儿的临床资料。所有患儿被分为联合输注组（Co 组）与双顺反子组（Bi 组），经淋巴清除预处理后，输注 CAR-T 细胞（剂量 2×106～10×106 个细胞/kg）。主要研究终点为输注后 30 天完全缓解（CR）/微小残留病（MRD）阴性率、总生存期（OS）、无事件生存期（EFS）及治疗相关毒性，随访截止日期为 2025 年 3 月 31 日。结果 共纳入 22 例 PAX5 基因变异 R/R B-ALL 患儿，包括融合变异 18 例（81.8%）、缺失 2 例（9.1%）及错义变异 2 例（9.1%），6 例（27.3%）患儿存在复杂核型（≥ 3 种异常）。其中 8 例接受联合输注 CAR-T 治疗（Co 组），14 例接受双顺反子 CAR-T 治疗（Bi 组）。患儿治疗时中位年龄 5.57 岁（范围 1.31～14.85 岁），其中男 13 例、女 9 例。Co 组与 Bi 组患儿输注后 30 天 CR 率均为 100%，且 MRD 均为阴性（MRD<0.01%）。中位随访时间 26.5 个月（范围 5～66 个月），22 例患儿 6 个月、12 个月、3 年 OS 率分别为 95.45%、90.91%、63.64%，6 个月、12 个月、3 年 EFS 率分别为 77.27%、54.55%、40.91%。Co 组 6 个月、12 个月、3 年 OS 率分别为 100%、87.5%、50%，Bi 组为 92.9%、92.9%、71.4%；Co 组 6 个月、12 个月、3 年 EFS 率分别为 75%、62.5%、37.5%，Bi 组为 78.6%、50%、42.9%，两组患儿 OS、EFS 率比较差异均无统计学意义（POS = 0.411，PEFS = 0.826）。共 4 例患儿在 CAR-T 治疗后接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT），移植组的 6 个月、12 个月及 3 年 OS 率分别为 100%、100%、50.0%，未移植组为 94.4%、88.9% 和 66.7%；移植组 6 个月、12 个月及 3 年 EFS 分别为 75.0%、75.0%、50.0% ，未移植组为 77.8%、50.0%、38.9%，两组间患儿的 OS、EFS 率比较差异均无统计学意义（POS = 0.693，PEFS = 0.553）。Co 组和 Bi 组的 ≥ 3 级细胞因子释放综合征发生率分别为 25.0% 和 57.1%，免疫效应细胞相关神经毒性综合征发生率分别为 25.0% 和 21.4%，均安全可控且未发生治疗相关死亡。结论 CD19/CD22 双靶点 CAR-T 的联合输注与双顺反子策略，对 PAX5 基因异常 R/R B-ALL 患儿均具有良好的短期疗效及安全性，但 3 年 EFS 率仍处于较低水平，提示长期预后仍有待进一步改善。

关键词

CD19/CD22 双靶点嵌合抗原受体 T 细胞； 复发/难治性 B 细胞急性淋巴细胞白血病； PAX5 基因变异； 异基因造血干细胞移植

引言

在过去十年，嵌合抗原受体 T 细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）治疗的快速发展为复发/难治性 B 细胞急性淋巴细胞白血病（relapsed/refractory B-cell acute lymphoblastic leukemia，R/R B-ALL）的治疗带来了革命性突破。其中，CD19 靶向单药 CAR-T 治疗在 R/R B-ALL 患者中实现了 70%～90% 的高完全缓解（complete remission，CR）率 [1-2]。然而，其长期疗效受抗原逃逸（复发的主要机制）的显著限制，肿瘤细胞通过下调或丢失 CD19 靶抗原表达以逃避 CAR-T 细胞的识别 [3-4]。临床研究显示，在接受 CD19 CAR-T 治疗的儿童 R/R B-ALL 患者中，CD19 阴性复发占所有复发类型的 30%～50%[3,5]。因此，明确 CD19 阴性复发的分子驱动因素对优化 CAR-T 治疗至关重要。现有证据表明，B 细胞恶性肿瘤中 CD19 表达的稳定性受谱系特异性转录因子 [如配对盒基因 5（PAX5）] 的严格调控 [6]，而破坏这些因子的遗传异常可直接导致抗原丢失。在这些调控因子中，PAX5 是调控 B 细胞谱系定向、分化及 B 细胞表面抗原（包括 CD19）表达的关键转录因子 [7-9]。B-ALL 发病机制的基础研究进一步证实，PAX5 是该疾病中最常发生变异的基因之一，约 1/3 的 B-ALL 病例通过缺失、重排、序列变异或局灶性基因内扩增导致 PAX5 表达失调 [10-12]。

为解决 CD19 抗原丢失引发的复发难题，扩大抗原覆盖范围的「双靶点 CAR-T 策略」被认为是突破单靶点治疗局限的关键手段。通过同时靶向两种 B 细胞特异性抗原，该策略可显著降低白血病细胞因单一抗原丢失而逃避治疗的概率 [13-14]。在众多潜在的补充靶点中，CD22 凭借其独特的生物学特性和临床证据，成为最理想的协同靶点之一。CD22 具有严格的 B 细胞谱系限制性，在 B 细胞恶性肿瘤中的阳性表达率超过 90%，使 CAR-T 细胞能精准识别肿瘤细胞并最大限度降低脱靶毒性；此外，CD22 的表达调控通路与 CD19 相互独立，即使在 CD19 低表达或阴性的高危 B-ALL 患者中，CD22 仍可保持表达；同时，CD22 CAR-T 治疗在 CD19 耐药患者中也能实现 70% 的 CR 率 [15-17]。

双靶点 CAR-T 治疗策略主要分为两类：①联合输注 CAR-T，即分别制备针对 CD19 和 CD22 的两种 CAR-T 细胞产品并联合输注；②双顺反子 CAR-T，通过单一载体在同一 T 细胞中表达两种不同的 CAR[18-19]。临床前期及早期研究表明，两种策略均较单靶点 CAR-T 治疗展现出更强的抗肿瘤活性 [20-22]。然而，针对高危亚型（如 PAX5 变异）患者，两种双靶点策略在疗效、安全性及细胞持久性方面的直接对比数据仍较为匮乏。

鉴于目前 PAX5 变异 R/R B-ALL 患儿中双靶点 CAR-T 治疗的对比数据稀缺，本研究回顾性分析了 22 例此类患儿，旨在对比 CD19/CD22 联合输注与双顺反子 CAR-T 治疗的疗效及安全性。通过分析治疗反应、生存结局、毒性反应及 CAR-T 细胞持久性，本研究拟明确两种策略在此类患儿群体中的应用价值，为双靶点 CAR-T 治疗的临床优化提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析 2019 年 11 月 5 日至 2023 年 5 月 31 日，安徽医科大学第二附属医院及上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心收治的 PAX5 基因变异 R/R B-ALL 患儿的临床资料。纳入标准：①年龄<18 岁；②均接受联合输注 CAR-T 或双顺反子 CAR-T 治疗；③符合 R/R B-ALL 诊断标准 [2]；④通过核型分析、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及二代测序技术明确 PAX5 基因变异。排除标准：①预计生存期<12 周；②无法控制的活动性感染；③患有自身免疫性疾病，中枢神经系统功能障碍，非黑色素瘤皮肤癌或原位癌以外的其他恶性肿瘤（除非疾病完全缓解时间超过 3 年）。

1.2 方法

1.2.1 CAR-T 细胞制备与输注 所有细胞制备流程均符合药品生产质量管理规范及临床实验室质量管理规范要求，制定了样本采集、处理及分析的标准操作规程。根据患儿体重及淋巴细胞计数，经外周静脉采集适量全血，采用密度梯度离心法分离 CD3+T 淋巴细胞。联合输注组（Co 组）：激活后的 T 细胞分别转染 CD19 靶向或 CD22 靶向 CAR 的第二代慢病毒载体（两种 CAR 均含 41BB 共刺激域及 CD3 -ζ信号域）；双顺反子组（Bi 组）：转染步骤采用 CD19 和 CD22 双 CAR 的单一双顺反子慢病毒载体，其余制备、质量控制及输注参数均保持一致。

所有患儿在 CAR-T 细胞输注前均接受淋巴清除化疗作为预处理。以 CAR-T 细胞输注日为第 0 天，具体方案如下：氟达拉滨 30～40 mg/m2，静脉输注，-4 天至-2 天每日 1 次；环磷酰胺 500 mg/m2，静脉输注，-4 天及-3 天每日 1 次。第 0 天输注 CAR-T 细胞，总剂量为（2～10）×106 个/kg。该预处理方案旨在减少体内淋巴细胞数量，为输注的 CAR-T 细胞扩增创造更有利的环境。

1.2.2 CAR-T 输注后评估 CR 定义为：外周血无原始细胞、无髓外病变，脑脊液检查阴性，骨髓原始细胞<5%，造血功能恢复（血小板> 100×109/L，中性粒细胞绝对计数>1×109/L）。复发定义为：达到微小残留病（minimal residual disease，MRD）阴性 CR 后，骨髓、外周血或髓外部位再次出现原始细胞。生存指标中，无事件生存期（event-free survival，EFS）指从 CAR-T 细胞输注至首次复发或死亡的时间；总生存期（overall survival，OS）指从 CAR-T 细胞输注至末次随访或死亡的时间。随访截止日期为 2025 年 3 月 31 日。

疗效评估节点包括入组时、CAR-T 细胞输注日（淋巴细胞清除化疗后）、输注后 7～14 天、28 天、3 个月、6 个月及 12 个月，评估内容包括骨髓穿刺行细胞形态学分析及 MRD 检测。MRD 采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测，抗体组合为 CD10-PECy7/CD34-PERCP/CD22 -APC/CD19-APCH7/CD20-V450/CD45-V500，在 BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪平台采集数据并进行软件分析；MRD 定义为肿瘤细胞占单个核细胞的比例，MRD 阴性标准为<0.01%。中枢神经系统（central nervous system，CNS）受累患儿在上述时间点同时行腰椎穿刺采集脑脊液，通过 FCM 检测原始细胞；非 CNS 髓外病变（如淋巴结、睾丸）通过体格检查、超声或活检评估。

毒性评估采用 BD 流式细胞术微球阵列（cytometric bead array，CBA）人 Th1/Th2 /Th17 细胞因子检测试剂盒，测定血清白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17 A、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）浓度；细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）及免疫效应细胞相关神经毒性综合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）根据美国移植和细胞治疗学会（ASTCT）标准进行评估与分级 [13]。

1.3 统计学分析

采用 Graphpad prism 9.0 统计软件进行数据处理。非正态分布的计量资料以中位数（最小值～最大值）表示。计数资料以 n（%）表示，组间比较采用 Fisher 精确概率法检验。Kaplan-Meier 法用于绘制生存曲线，采用 Log-rank 检验比较组间生存差异。以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿基线特征

共纳入 22 例 PAX5 基因变异 R/R B-ALL 患儿，基线特征见表 1。分子检测显示，22 例患儿 PAX5 基因变异类型具有异质性，包括融合变异 18 例（81.8%）、缺失 2 例（9.1%）及错义变异 2 例（9.1%）；6 例（27.3%）患儿存在复杂核型（≥ 3 种异常）。其中 8 例接受联合输注 CAR-T 治疗（Co 组），14 例接受双顺反子 CAR-T 治疗（Bi 组）。患儿治疗时中位年龄 5.57 岁（范围 1.31～14.85 岁），其中男 13 例、女 9 例。所有患儿 CAR-T 治疗前均未接受过博纳吐单抗（blinatumomab）治疗，仅 Co 组 1 例患儿既往接受过异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）。

21 例患儿复发时累及骨髓，10 例合并髓外复发（CNS 复发 5 例、睾丸复发 5 例）。患儿基线 MRD 中位水平为 11.32%。Co 组 CD19/CD22 CAR-T 细胞联合输注中位总剂量为 5.0×106（范 围 1.8×106～8.7×106）个/kg，CD19 CAR-T 细胞平均转染效率为 49.3%、CD22 CAR-T 细胞为 46.6%；Bi 组 CD19/CD22 双顺反子 CAR-T 细胞输注中位总剂量为 5.1×106（范围 2.3×106～10.0×106）个/kg，CD19 CAR-T 细胞平均转染效率为 41.0%、CD22 CAR-T 细胞为 50.0%。

2.2 治疗反应

Co 组（8 例）与 Bi 组（14 例）患儿输注后 30 天 CR 率均为 100%，且 MRD 均为阴性（MRD<0.01%）（表 1）。截至 2025 年 3 月 31 日，中位随访时间 26.5 个月（范围 5～66 个月），22 例患儿 6 个月、12 个月、3 年 OS 率分别为 95.45%、90.91%、63.64%，6 个月、12 个月、3 年 EFS 率分别为 77.27%、54.55%、40.91%。Co 组 6 个月、12 个月、3 年 OS 率分别为 100%、87.5%、50%，Bi 组为 92.9%、92.9%、71.4%；Co 组 6 个月、12 个月、3 年 EFS 率分别为 75%、62.5%、37.5%，Bi 组为 78.6%、50%、42.9%。两组患儿 OS、EFS 率比较差异均无统计学意义（POS = 0.411，PEFS = 0.826 ；图 1A、1B）。Co 组患儿中位 OS 为 26 个月，Bi 组患者中位 OS 尚未达到。共 4 例患儿在 CAR-T 治疗后接受 allo-HSCT，移植组的 6 个月、12 个月及 3 年 OS 率分别为 100%、100%、50.0% ，未移植组为 94.4 %、88.9% 和 66.7%；移植组 6 个月、12 个月及 3 年 EFS 分别为 75.0%、75.0%、50.0% ，未移植组为 77.8%、50.0%、38.9%，两组间患儿的 OS、EFS 率比较差异均无统计学意义（POS = 0.693，PEFS = 0.553；图 1C、1D）。

2.3 安全性与细胞因子变化

安全性分析结果见表 2。两组均出现 ≥ 3 级 CRS，Co 组发生率为 2/8（25.0%），Bi 组为 8/14（57.1%），差异无统计学意义（P= 0.204）；Co 组 CRS 中位持续时间为 4d（范围 2～8d），Bi 组 6.5d（范围 2～9d），差异无统计学意义（Z= 1.71，P= 0.087）。CRS 患儿中，Co 组 6 例、Bi 组 9 例使用托珠单抗治疗，Co 组 2 例、Bi 组 3 例使用糖皮质激素治疗。20 例患儿出现发热，Co 组和 Bi 组各 1 例无发热。

两组均出现 ICANS，Co 组 2 例（25.0%，中位持续时间 1.5d），Bi 组 3 例（21.4%，中位持续时间 7d），两组 ICANS 发生率差异无统计学意义（P= 1.000）。Co 组 2 例、Bi 组 8 例患儿出现低血压；Co 组 1 例、Bi 组 1 例患儿出现癫痫发作。

IL-6、IFN-γ是 CAR-T 输注后 CRS 发生的关键介质，其中 IL-6 是核心生物标志物。本研究对两组患儿输注后 IL-6、IFN-γ水平进行动态监测：Co 组 6 例患儿的 IL-6 水平升高明显，IL-6 与 IFN-γ峰值均出现在输注后 7d 内（图 2A、2C）；Bi 组血清 IL-6、IFN-γ峰值同样出现在输注后约 7d 内，变化趋势与 Co 组相似（图 2B、2D）。

采用 qPCR 动态检测患儿外周血中 CAR-T 细胞拷贝数，结果显示 CAR-T 体内扩增均呈典型「先升后降」动力学曲线，扩增高峰多出现于输注后第 6～7 天（图 3A、B），在 Co 组例 4 和 Bi 组例 19 患儿中，分别在 CAR-T 回输后 325d 和 532d 外周血中仍能检测到 CAR-T 细胞。Co 组（n= 6）与 Bi 组（n= 5）CAR-T 中位峰值拷贝数分别为 127.3×103 拷贝/μg DNA 与 748.4×103 拷贝/μg DNA，Bi 组整体水平高于 Co 组，但因样本量较小、统计效能有限，两组间差异未达到统计学意义（Z= 1.53，P= 0.126，图 3C）。

B 细胞再生障碍是评估 CAR-T 细胞治疗持久性与疗效的重要指标。Co 组 8 例患儿均检测到 B 细胞持续缺失时间，中位持续缺失时间为 150d（范围 100～303d）；Bi 组 11 例可评估患儿中仅 9 例检测到 B 细胞恢复，其余 2 例（包括例 10、例 16）直至末次随访仍未检测到 B 细胞，中位持续缺失时间为 93d（范围 27～1098 d）。见表 2。

3 讨论

本研究聚焦于 PAX5 基因变异的 R/R B-ALL 患儿。传统研究多纳入未筛选的 R/R B-ALL 患儿，未明确遗传学亚型，仅关注 CD19/CD22 双靶点 CAR-T 治疗的整体疗效；而本研究首次以 PAX5 基因变异为核心分层标准，针对性比较两种不同 CD19/CD22 CAR-T 治疗策略的疗效与安全性。

短期疗效方面，联合输注组（Co 组，8 例）与双顺反子组（Bi 组，14 例）患儿输注后 30 天 CR 率及 MRD 阴性率均达 100%，显著优于传统单靶点 CD19 CAR-T 治疗在高危 B-ALL 中的表现，证实双靶点覆盖可有效规避 PAX5 变异肿瘤细胞的单一抗原逃逸风险。经随访（中位时间 26.5 个月）发现，两组 6 个月、12 个月、3 年 OS、EFS 率比较差异均不显著，但两组 3 年生存率均处于较低水平，提示 PAX5 异常 B-ALL 患儿即使接受双靶点 CAR-T 治疗，长期复发风险仍较高，预后仍有待进一步改善。尽管既往研究提示 CD19 CAR-T 治疗可能增加 CRS 风险，本研究中 Bi 组 ≥ 3 级 CRS 发生率略高于 Co 组，且 CRS、ICANS 中位持续时间更长，但两组 CRS、ICANS 的发生率差异均不显著。所有毒性经托珠单抗、糖皮质激素等干预后均可控制，无治疗相关死亡发生。本研究中 4 例 CAR-T 治疗后接受 allo-HSCT 的患儿，其 OS、EFS 与未接受 allo-HSCT 患儿比较差异不显著；虽因移植组样本量较小（4 例）导致统计效能不足，但移植患儿 12 个月、3 年 EFS 率显示出更高的趋势，提示移植可能是更优治疗选择，未来需扩大样本量进一步观察。

本研究可能是首个分析 CD19/CD22 双靶点 CAR-T 治疗 PAX5 基因变异 R/R B-ALL 患儿短期疗效的研究，两种双靶点策略疗效与安全性相当，但后期高复发率仍是亟待解决的难题。多项研究提示，不同 PAX5 变异亚型可能对靶分子产生差异性影响，例如 Li 等 [23] 报道，PAX5 基因变异可影响相关靶点，导致抗原丢失或表达水平降低（如 CD58、CD19 表达下降，其中 PAX5-p80R 变异与 CD58 表达降低关联尤为密切）。针对 PAX5 变异导致的 CD19 表达潜在不稳定性，Orlando 等 [24] 分析了 12 例 CAR-T 治疗后发生 CD19 阴性复发的患者，发现其 CD19 外显子存在遗传变异，但 CD22、CD20、CD10、CD34、CD38、CD45 等其他 B 细胞抗原基因未检测到复发相关变异，这些基因可作为未来研究的新型靶点，具有重要探索价值。此外，Nix 等 [25] 证实，CD72 靶向 CAR-T 细胞可有效清除 CD19 表达缺失的肿瘤细胞，这一发现不仅为 CD19 表达不稳定或阴性肿瘤的治疗带来新希望，也为进一步探索 CD19/CD72、CD22/CD72 等双靶点组合提供了理论基础与实验依据。除上述靶点外，CD20、CD23、CD79b、CD37、BAFFR 等多个 B 细胞限制性受体也已成为潜在治疗靶点 [26-30]。

综上，本研究证实 CD19/CD22 双靶点 CAR-T 治疗对 PAX5 基因变异 R/R B-ALL 患儿具有良好短期疗效，联合输注与双顺反子策略安全性相当，PAX5 变异可能是两种双靶点 CAR-T 治疗的不良预后因素，即使桥接 allo-HSCT 后仍存在较高后期复发率，表明 PAX5 变异可能损害治疗应答的持久性。

由于本研究为回顾性设计且样本量有限，上述结论需进一步验证。未来将通过多中心前瞻性试验扩大 PAX5 变异患儿队列，细化 PAX5 变异亚型（如融合、缺失、点突变）的亚组分析，并系统评估非 CD19 依赖的双靶点 CAR-T 策略疗效，为 PAX5 基因变异 R/R B-ALL 患儿的精准治疗提供更充分的证据支持。