武汉大学中南医院血液内科刘银博士后在自然子刊 Nature Communications 上发表研究成果

近日，武汉大学中南医院血液内科刘银博士后/周芙玲教授团队和中国农业科学院深圳农业基因组研究所王鑫杰研究员、李奎教授共同通讯在综合性国际顶级学术期刊 Nature Communications(中科院一区，TOP 期刊) 上发表研究论文，题为「CoHIT: a one-pot ultrasensitive ERA-CRISPR system for detecting multiple same site indels」（CoHIT：一管法检测同位点多插入缺失突变亚型的超灵敏 ERA-CRISPR 系统）。

随着癌症精准医疗的发展，基因突变检测在各种癌症的诊断、分型、靶向治疗和病情监测等方面显示出越来越重要的价值，这也使得临床基因检测技术有了更快速、更灵敏、更便捷、更经济的需求和挑战。目前常规的一代测序、二代测序以及基于 PCR 的检测方法仍然存在一些局限性，或灵敏度不足，或周转时间较长，或依赖大型仪器等。此外，同一位点多突变亚型的存在也增加了检测技术的假阴性风险。以急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）中最常见的 NPM1 基因 c.863_864 四碱基插入突变为例，已报道有百余种突变亚型，这些移码突变完全改变了突变 NPM1 蛋白的细胞亚定位 (核仁到细胞浆)，是影响 AML 预后的重要因素，因此也是血液肿瘤中重要的检测项目。

为了克服类似于 NPM1 的插入缺失（Insertion and deletions，indels）突变的多亚型覆盖检测难点，研究团队通过构建一种具有碱基错配耐受性的 AsCas12a 蛋白变体 enAsU-R，并将 CRISPR/Cas12a 核酸检测技术和 ERA（Enzymatic Recombinase Amplification）等温扩增技术整合优化为一锅法体系，建立了一种可以利用单条 crRNA 检测同一位点多种相似 indels 的检测方法 CoHIT(Cas12a-based One-for-all High-speed Isothermal Test），如图 1，这一方法对 NPM1 突变的常见亚型可达到 0.01% 的检测灵敏度，且操作简便（一步法）、用时短（30 分钟内）、设备需求低（使用蓝光照胶仪或便携式恒温荧光检测仪）、成本低廉（无昂贵试剂成分）。此外，CoHIT 方法对 EGFR 基因 p.E746_A750del 突变亚型、BRAF 基因 p.V487_T491del 突变亚型、KIT 基因 p.W557_K558del 突变亚型等的检测同样适用。

研究者将 CoHIT 方法应用于临床 108 例 AML 患者的血液样本检测，成功从中识别出 30 例 NPM1 基因突变患者样本，与二代测序结果一致。这些阳性病例不仅有最常见的 c.863_864insTCTG 突变亚型，还包含 c.863_864insCATG、c.863_864insCTTG、c.863_864insCCTG 等较少见的突变亚型，证明了 CoHIT 方法的实用性。

另外，许多白血病患者治疗缓解后或骨髓移植治疗后体内可能仍然残留有少量的白血病细胞，这种状态称为微小残留病（minimal residual disease，MRD），其检测对于患者预后具有重要价值，而 NPM1 基因突变是指南认定的重要 MRD 监测指标。研究者收集了三名 AML 患者从初诊至缓解再至复发的不同时间点血样，对这些样本 DNA 进行检测，证明 CoHIT 方法可早期提示 MRD 的存在，对患者复发和及时介入治疗具有潜在的指导意义（如图 2）。

此外，CoHIT 方法还可进一步与试纸条和微流控芯片进行灵活的结合应用，以配合不同医疗条件和临床需求。