MICM 整合诊断技术解析（三）：免疫学分析

在上两期的连载内容中，高博医学（血液病）北京研究中心北京高博博仁医院童春容主任为大家介绍了 MICM 整合诊断中细胞形态学及细胞化学染色和组织病理学的特点，本期继续 MICM 整合诊断技术中免疫学分析相关知识的解析。

一、概述

免疫学分析主要包括免疫组织化学染色（IHC）和流式细胞术（FCM），方法是采用不同染料或荧光染料标记的单克隆抗体（单抗，mAb）对细胞悬液、细胞涂片或骨髓组织切片进行染色，然后在流式细胞仪或荧光显微镜或光镜下观察细胞表面或细胞内的抗原标记。

免疫分析技术是确定血液肿瘤细胞系列，如 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、髓系细胞、自然杀伤（NK）细胞、自然杀伤性 T（NKT）细胞、淋巴样浆细胞、浆细胞、树突细胞（DC）和非血液淋巴系统细胞等的关键技术。尤其是双表型、双克隆性、甚至多系列的血液肿瘤只能通过免疫学分析来诊断。

该技术也是确定血液肿瘤细胞分化受阻阶段（早期或前体或原始，晚期或成熟或外周）的关键技术。以急性白血病为例，如果形态学、细胞化学染色联合 FCM，诊断与分型的准确率及一致率可达 90% 以上，且重复性高。

急性白血病病情发展速度很快，甚至可能在一天之内迅速恶化，因此需要快速诊断并治疗。根据形态、细胞化学染色和 FCM 对急性白血病的诊断和分类，最快几个小时就可明确疾病诊断，医生可先根据这两份结果对患者进行治疗，避免延误急性白血病的治疗时机。

二、IHC

IHC 一般用染料或荧光染料标记的抗体对组织病理切片的组织细胞染色，抗体与抗原结合后标记的染料显色，可在光镜下观察着色反应；或荧光素发出荧光，可在荧光显微镜下观察荧光反应，从而了解细胞表达的免疫标志。IHC 是目前病理检查最广泛应用的方法，一般与组织病理普通染色同时进行。

1、IHC 的优点

病理组织标本 IHC 具有组织病理的优点，在此基础上进行 IHC，比 FCM 更容易确定某一免疫标志阳性或阴性细胞在组织部位的定位；对一些抽不出的细胞、少见细胞、体积很大的细胞等也可判断；一些免疫标志用 IHC 检测比 FCM 更准确，如细胞周期蛋白 D1（cyclin D1，CCND1）等。

2、IHC 的局限性

IHC 一般每次染色只能用一种抗体，但很少有一种免疫标志是恶性细胞特有的标志。

在免疫标记染色后，细胞形态特点不清楚，很难在不同染色切片对同一类细胞定位并确定这类细胞表达的全部标志，尤其是对那些不破坏组织结构的血液肿瘤细胞、或血液肿瘤细胞没有定位于特定的组织结构区域，与反应性良性细胞混合分布的病理标本。

此外，在血液肿瘤细胞比例明显比正常细胞少的情况下，仅根据 IHC 难以鉴定细胞的良恶性、恶性细胞的细胞系列及分化阶段；目前有些抗体很难成功用于 IHC 染色和分析，如 T 细胞抗原受体（TCR）αβ或γδ链、免疫球蛋白轻链、TCRvβ区，因此采用 IHC 很难诊断γδT 淋巴瘤，也很难进行成熟 B 细胞、T 细胞的克隆性分析。

同样，IHC 的诊断医生需要具有组织病理医生那样丰富的知识和经验，还要了解 IHC 染色试剂的优缺点。

三、FCM

FCM 是将标本制备成单个细胞悬液，然后将这些用荧光染料标记的单抗标记细胞通过流式细胞仪进行检测的方法。流式细胞仪可以探测单个细胞的大小、细胞内颗粒的多少，及标记在细胞上的荧光光谱，并将光信号转化为电信号，用计算机存贮下来，再用分析软件进行分析。

1、FCM 的优点

流式细胞仪除了直接探测细胞的大小、细胞内颗粒的多少外，还可一次性检测同一个细胞上 3～10 余种免疫标志是否表达、表达强度、不同免疫标志之间的关系。

如果含有不同细胞群的标本在同一试管染不同的荧光标记的抗体，那么就可以划出有同样荧光标记的一群细胞所在区域（设门），然后分析和计算该细胞群的特征和数量。

FCM 可以在几个小时内完成对同一患者几十万个细胞上数百种标记的分析，比 IHC 更为快速、简便，一致性及重复性更好。

FCM 可检测多种标本，如血液、骨髓、活检组织、各种细针或粗针穿刺标本、胸水、腹水、脑脊液等多种体液，因此容易检测血液肿瘤在其它部位的浸润。

虽然血液肿瘤细胞上的单个免疫标志与正常细胞差异很小，但是综合多种免疫标志的分析，大多数的恶性血液细胞具有一些异常表达的现象，可帮助判断细胞的良恶性。而与形态、组织病理、IHC 相比，FCM 更容易判断细胞的良恶性。

例如，恶性成熟 B 细胞和恶性浆细胞膜或胞浆限制性表达单一的免疫球蛋白（Ig）轻链（κ或λ），而正常成熟 B 细胞膜或浆细胞胞浆内表达κ或λ的细胞比例一般为 3:2；正常成熟 T 细胞上 T 细胞抗原受体抗原（TCR）为多克隆表达，而恶性 T 细胞 TCR 抗原为某一克隆明显增加，其它克隆明显减少；血液肿瘤细胞还可有脱氧核糖核酸（DNA）倍体异常、抗原表达过强、应该表达的抗原丢失、不同系列细胞的抗原同时表达、早期晚期抗原同时表达、罕见细胞（如 TCRγδ+T 细胞等）明显升高等。

在此基础上，也更容易判断恶性细胞的系列来源及成熟阶段。因为很多免疫标志在正常细胞上也存在，因此进行血液肿瘤免疫分型时应该确定免疫标志在血液肿瘤细胞上，而不是简单地根据某一免疫标志的细胞的数量来判断。

尤其是当组织中存在大量的正常细胞，肿瘤细胞比例很低时；或有正常早期细胞标志的细胞反应性增加时；单纯用 IHC 判断肿瘤细胞的系列来源及分化阶段可能误诊。

比如，当原始细胞只有 20%，而正常粒细胞 ≥ 50% 时，此时根据粒细胞标志细胞占全部有核细胞（ANC）的比例就诊断急性粒细胞白血病是完全错误的。

因此，很多免疫表型复杂的血液肿瘤用 FCM 来诊断比较容易，用 IHC 诊断却很困难，比如同一患者存在多种恶性血液肿瘤克隆，如 T、B、浆细胞、髓系共存，淋巴瘤和急性白血病共存，甚至有血液肿瘤和其它系统肿瘤共存的现象，如浆细胞肿瘤和肺癌共存等。

FCM 还可以对一些转移癌等非造血系统肿瘤做出提示性诊断，我们中心就使用 FCM 在组织、脑脊液、骨髓、血液等标本中查出过肺癌、神经母细胞瘤等。

由于 FCM 检查的细胞数很多，分析的标记多，FCM 可以检查很微量的血液肿瘤细胞，敏感性可达 10-3～10-4；且覆盖面广，对>80% 的血液肿瘤细胞都可用 FCM 检测，因此是监测治疗后微小残留肿瘤（MRD）的最常用方法，而且可以很快报告，及时调整治疗方案。

血液肿瘤细胞上的一些分化抗原决定簇（CD），如 CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD70、CD138、CD371、BCMA 等，针对这些抗原，已经有相应的抗体，嵌合性受体基因转染的 T 细胞（CAR-T）等有效治疗方法，因此检测这些标记可帮助选择靶向性的抗体或 CAR-T 治疗。

靶向治疗后，肿瘤细胞上的这些抗原还有可能丢失，因此监测这些抗原的变化可指导更精确的靶向治疗。

有些免疫标志代表血液肿瘤的预后不好，如 CD34+CD56+的急性髓系白血病（AML）、混合细胞性急性白血病（MPAL）等，因此免疫分型也有一定的预测预后的意义。

2、FCM 的局限性

与形态、组织病理及 IHC 相比，FCM 需要检测液态细胞，不能观察到病理结构，不能将细胞定位于组织部位。一些太大的细胞，如巨核细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、多核巨细胞等可能检测不出。一些无免疫标记异常的细胞也难以确定其良恶性，如一些红白血病的幼红细胞。

此外，FCM 需要将标本处理成单个细胞悬液，并染色，甚至洗涤，一些血液肿瘤细胞在标本运送、处理过程中死亡（如幼红细胞、大 B 细胞淋巴瘤细胞容易破坏），可能检测不到，或检测的比例与形态或病理明显不符；脑脊液、其它体液或组织的细胞，如果没有血清等保护，或时间较长也容易破坏。

在比例方面，如果骨髓中正常幼红细胞大量破坏，会导致有核细胞比例失常，肿瘤细胞比例高于形态或病理结果；如果肿瘤细胞破坏或标本稀释则会导致肿瘤细胞低于形态或病理。另外，抽骨髓时一般第一针首先抽少量骨髓血涂片进行形态学分析，此后抽取骨髓血做染色体甚至基因，如果最后才抽取做流式分析，会导致大量血液稀释骨髓。

一些恶性细胞与组织黏附性高，难以穿刺吸出或在组织标本时不能成为单个细胞悬液，FCM 也会漏诊。

还有值得注意的是，FCM 诊断所用的有些标志如 CCND1 不如病理敏感，因此诊断套细胞淋巴瘤要结合 IHC。很多类型的血液肿瘤有共同的免疫标志，如各类前体 B、T、髓系细胞肿瘤仅依据 FCM 尚不能对亚型作出准确诊断和分型。

FCM 对诊断技术人员的要求也很高，需要在以下多方面有丰富的知识和经验：血液病临床特征、正常细胞分化发育过程中免疫标志的变化规律、疾病的免疫标志特点、不同厂家不同克隆号抗体及其标记的荧光光的特点，不同荧光标记抗体组合后的变化，怎样识别需要深入分析的目标细胞（设门），仪器及应用软件的标准化、调试等等。

目前 FCM 分析细胞参数时是一次性平面分析两个参数，然后将多次的平面分析组合起来形成结论，这也需要 FCM 诊断医生有丰富的知识和经验。

FCM 需要分析活的细胞，需要的细胞数量多，对活性不好的细胞容易出现非特异染色，细胞数量很少的标本容易导致分析不全面，容易出现误诊或漏诊。

3、FCM 相关专家共识、标准、指南的解读

2008 和 2016 世界卫生组织造血与淋巴组织肿瘤分类的标准中提出了区分不同阶段、不同系列血液肿瘤的免疫标志特点。但是 FCM 判断是否为血液肿瘤细胞不仅仅根据细胞上表达什么标志，还要通过分析细胞上多种抗原表达和组合异常来判断是否为血液肿瘤细胞，然后再判断血液肿瘤细胞的比例、成熟阶段及系列来源。

FCM 诊断的正确性与标本处理方式、仪器校准、检测抗体的选择、抗体组合、目标细胞的设门、抗原表达比例及强度的判断，诊断医师分析的仔细程度、知识水平及经验等因素都有关，目前国内外不同单位的检测结果尚不易被互认，尤其对血液肿瘤细胞比例很小的 MRD 的监测，差异及分歧很大。国际上一些协作组监测 MRD 时，一般仅选择几个实验室来报告。

为了减少不同实验室之间的报告误差，国际上先后出台了一些 FCM 诊断血液肿瘤的专家共识。国际血液学标准化委员会（ICSH）、国际临床流式学会（ICCS） 、欧洲白血病网络（ELN）、英国血液学标准委员会（BCSH）等都制定了一系列的 FCM 诊断血液病的实践指南。

随着 FCM 知识的普及，国内 FCM 实验室在诊断血液肿瘤方面有很大进步，但是对淋巴瘤的诊断及分型，很多肿瘤医院或肿瘤科尚未把 FCM 列为常规诊断，因此尚需要努力普及宣传这方面的知识。