二代测序技术助力血液肿瘤临床探索

近十几年以来，随着二代测序技术的突破性发展，基因测序的成本以超摩尔定律的趋势快速降低。现在，人类的一个全基因组测序价格已经降至几百美元，与人类基因组计划耗资 30 亿美元比较，已是天壤之别。伴随成本的降低，二代测序技术也从单一的科研领域开始进入与大众生活息息相关的医疗诊断等领域，比如肿瘤，生殖健康，遗传病，病原微生物等等。

血液肿瘤是起源于造血系统的一大类恶性肿瘤的统称，主要类别包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等。血液肿瘤具有高度的空间异质性（相同肿瘤不同区域不同）与时间异质性（原发性肿瘤与继发性肿瘤不同），从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。而肿瘤细胞基因层面的变化是导致这种异质性的关键因素。

在《Leukemia》最新发表的文章中，高博医疗集团北京博仁医院的潘静主任结合临床实践经验，分享 TP53 突变患者在 CD19 CAR-T 细胞治疗后的临床转归相关问题。

CD19 CAR-T 治疗会取得高缓解率，但复发仍然存在，并且每个病人复发的形式都不一样，那么问题出在哪里？一份复发患者的基因突变检测报告，能否对后续的治疗选择带来帮助，进行分层治疗？带着这些疑问，研究人员总结一期临床试验入组的 68 例患者，纳入 32 个相关的因素，包括 MICM 特征，339 血液肿瘤突变基因，CAR-T 相关因素，后续治疗方式等，建立竞争风险模型，寻找与预后相关的因素。此外，对复发病人进行分析，选取 6 例具有临床标本的患者进行肿瘤细胞的分选工作，分别进行了临床复发病人的转录组测序（RNA seq）和全外显子组测序（WES），寻找复发的机制。

利用二代测序技术，检测 339 个血液肿瘤相关基因，发现在入组患者中 TP53 的突变频率高达 25%，同时，携带 TP53 突变的患者复发率达 60% 以上，此外，除 TP53 突变外还包括 STAG2，也是急淋患者复发的一项高危因素。通过建立竞争风险模型，纳入 32 项相关因素之后的结果发现影响预后的主要因素有三个，分别为 TP53 突变、STAG2 突变和基因突变的数量，这三个主要预后因素的检测均需通过二代测序技术完成。

进一步的研究发现，TP53 突变多发生在 DNA 结合区域，如果一旦这个蛋白的结合位点发生突变，蛋白功能将受到严重影响。同时，临床研究结果显示，具有 TP53 突变的患者 DFS 明显低于没有 TP53 突变的患），患者一旦携带 TP53 突变，不论携带其他多少突变，预后都是非常差的，TP53 突变是预后的决定性因素。

TP53 作为重要的抑癌基因，自身的突变将会导致染色体的不稳定，使其获得新的突变。如图 7 所示，A 为没有接受 CAR-T 治疗的患者，B 为没有 TP53 突变接受 CAR-T 治疗后的患者，C 和 D 为有 TP53 突变接受 CAR-T 治疗后的患者。圆形中的红色线代表患者的融合基因，我们可以清晰 的 发现 TP53 突变患者 CAR-T 治疗后与没有接受 CAR-T 治疗的患者相比融合基因显著增加。

这也解释了为什么 TP53 突变患者肿瘤细胞克隆演变快，以至于在 CAR-T 压力下发生克隆演变，抗原丢失导致复发，比如之前报道的 CD19 外显子 2 或 4 丢失，导致 CD19 表达下调或者 CD19 CAR-T 无法再接触。

文章中建立竞争风险模型，寻找与预后相关的因素时，339 血液肿瘤突变基因作为重要因素纳入考量。该检测全称是：血液肿瘤相关基因突变筛查 (339 基因)，采用先进的高通量 NGS 测序技术，对样本 DNA 进行靶向捕获测序，检测血液系统疾病相关的 339 个基因全编码区及可变剪接位置的全部单核苷酸位点变异（SNV）和小片段插入/缺失（Indel）变异，平均测序深度 3000X 以上，变异频率检测下限达到 1%，自主开发的 FLT3-ITD 检测流程，可检测低频、复杂的 FLT3-ITD。

同时，根据 FDA、NCCN 指南推荐的用药指导，WHO 分类指南，国际会议专家共识或有多中心 RCT 研究提供的循证医学证据，形成完善的生物信息知识库，结合临床进行精准解读。

开展检测的高博医学诊断中心，由具备 30 余年检验及诊断研究经验的专家团队领衔，总面积达 5000m2，是全球实验室建设领导者赛默飞世尔中国（Thermo Fisher）在中国合作的为数不多的精准诊断合作实验室之一。

高博医学诊断中心分子实验室，配备了先进的 qPCR，一代测序和二代测序检测设备，现已开展血液肿瘤相关的数百项检测，覆盖诊断分型，预后检测，遗传易感，用药指导等各个方面。

作为该篇《Leukemia》文章的共同联系作者，分子实验室主任郑勤龙博士，为现任美国癌症研究学会会员，具有 30 多年癌症等疾病的实验室检测与研究经验，曾在美国国立癌症研究所（NCI），美国洛杉矶加州大学临床病理和检验医学系，美国俄克拉荷马大学健康中心等有多年工作经历。